Discovery Studio官方教程-基于MODELER构建抗体模型

目的： 通过此教程，了解Discovery Studio中基于抗体序列构建抗体全长及Framwork区模型的操作方法及结果分析。

所需功能和模块：Discovery Studio Client，DS Sequence Analysis，DS MODELER，DS Protein Families，DS Validate Protein Structure。

所需数据文件：MA5_H.bsml、MA5_L.bsml

所需时间：1小时

介绍

抗体分子是生物学和医学领域用途最为广泛的蛋白分子。以肿瘤特异性抗原或肿瘤相关性抗原、抗原独特型决定簇、细胞因子及其受体、激素及一些癌基因产物作为靶分子，利用传统的免疫方法或通过细胞工程、基因工程等技术制备的多克隆抗体、单克隆抗体、基因工程抗体广泛应用于疾病诊断、治疗及科学研究等领域，并以其毒副作用小、天然和高度特异性的疗效，创造出了巨大的社会效益和经济效益。

抗体和抗体-抗原复合物的结构通常被用于了解基于抗体的药物的作用机制,在抗体工程上提供帮助。X射线晶体学方法有助于抗体结构的解析，但是与计算模拟相比，耗费的经济成本和时间成本太高。

本教程中使用DS基于一个合成人类Fv区域的序列构建3D抗体模型，相对于X射线晶体结构选择性评估模型的质量。随着大量的抗体Fv区域、Fab区域和高度保守区的结构被解析出来，使用同源模建的方法构建抗体结构成为可能。构建一个抗体Fv或Fab区域结构模型的一个典型的流程是首先根据已知抗体模板结构构建框架结构，然后必要的时候使用额外的模板优化互补决定区。在本教程中的任务包括以下几个步骤：

结构模板的识别
抗体Framework区模型的构建
构建抗体Loop区
模型可靠性的评估
抗体序列的分析和识别

载入序列。在本教程中对于序列的分析这一步对于构建抗体结构不是必须的，但是对于序列的分析有助于了解你即将构建的抗体模型的结构成分。Annotate Antibody Sequence protocol可使用一些预处理后的隐马尔科夫模型对抗体序列中的结构域和CDR区进行识别和注释。

在文件浏览器（Files Explorer）中，展开Sample| Tutorials|   Protein Modeling，双击打开MA5_H.bsml、MA5_L.bsml文件。关闭DS欢迎页面，选择MA5_L Sequence Window，打开Macromolecules |   Model Antibody工具面板， 鼠标左键点击Annotate Antibody Sequence.确保 Input   Sequences设置为MA5_L:All,其他参数使用默认，点击Run等待任务完成。

上述两个序列依次分别为抗体MA5的重链（H）序列和轻链（L）序列。

计算完成之后会自动打开一个序列注释结果窗口（如上图），蓝色的表示轻链可变区，粉红色的表示CDR loop区，同样的结构域在序列注释窗口显示同样的颜色。如果你在序列注释窗口中选择一段loop区，相应的氨基酸会在下方的序列窗口中以同样的颜色显示出来。

小技巧：鼠标右键点击序列窗口的标尺工具可以选择Residue ID，显示出每个氨基酸的残基号。

同理，可以用同样的方法把重链的序列分析注释显示出来。

Framework区模板的识别

在工具浏览器（Tools Explorer）中, 展开 Macromolecules | Model Antibody，点击打开 Identify Framewwork   Templates。

设置Light Chain Sequence为MA5_L:MA5_L

设置HeavyChain Sequence为MA5_H:MA5_H

其它参数默认，点击Run运行（图1）

作业大概需要一分钟的时间。待作业完成后，点击Report页面，查看Summary。报告的页面有四张表格，第一张表格是根据Similarity得到序列相似性最高的表面、轻链、重链模板，以下三张表格分别是搜索得到的所有的表面、轻链、重链模板。

抗体Framework区建模有两种方法：嵌合方式、单模板方式。嵌合方式能较全面的考虑轻链、重链模板的结构信息，同时根据表面模板决定轻链、重链的空间取向，但有时来自两条不同蛋白的轻链、重链模板与第三条表面模板叠合时，空间取向可能会不准确。无论嵌合方式或单模板方式建模，模型的质量都与搜索得到的表面模板或轻链模板、重链模板序列相似性有很大的关系，同时CDR区的的序列相似性对Framework区结构质量也起很大的作用。

本教程采用单模板方式进行抗体Framework区建模，点击Summary下第二张表格Overall Templates中的Identify（%）两次，使其按照Identify降序排列，点击第二个2XWT_BA，载入结构（图2）。

注意: 模板4M6M_LH是表中最匹配的模板，相似性和一致性都达到100%，这个模板就是本教程中的序列的晶体结构，为了后续的对比，我们在此不使用这个模板。

再次排序之后列表显示2XWT_BA的相似性达到94.4%，一致性达到89.4%，分辨率为1.9埃。如果你使用相似性排序，你会注意到2XWT仍然是比3MLW匹配度高。物种属性表明2XWT是一个人源抗体，对于合成的人类抗体序列是很合适作为模板的。你可以设置模板识别参数进行筛选，比如设置物种来源或NCBI taxomomy ID，或者更高分辨率的晶体结构。

抗体的最大的变化位于CDR区，在该区形成抗原结合位和明确抗体特异性。模板相似性和一致性的百分比，包括CDR区可以帮助你比较结果。

在右边模板识别结果报告网页的最下面，点击Overall Framework Hits Alignment链接。如下图

点击后在序列窗口中自动打开了一个叠合好地序列窗口（如上图），比较2XWT和3MLW的H3 LOOP区（213-232号残基）可以发现前者在这一区域中的长度与目标序列更接近。

回到右边报告网页中的第二个列表中，点击3MLW_LH.

在同一个分子窗口中多出了一个3MLW的结构，我们可以看到最大的结构变化位于H3 LOOP区。基于模板的检查和晶体结构分辨率的比较，我们选择使用2XWT作为模板构建我们的抗体结构，它具有高度的序列相似性和一致性，相似的H3 LOOP区的长度和较高的分辨率。

关闭模板识别报告窗口，序列注释窗口和叠合序列窗口。 

构建目标序列的3D模型

在本教程中，我们将使用Model Antibody Framework protocol构建抗体结构模型，这个protocol同样可以用于构建Fab 抗体。

1  构建模型

在工具浏览器（Tools Explorer）中，展开Macromolecules | Model   Antibody，点击Model Antibody Framework，打开Model Antibody Framework对话框。

点击Light Chain Sequence右边的栅格，下拉列表中选取MA5_L:MA5_L。

点击Heavy Chain Sequence右边的栅格，下拉列表中选取MA5_H:MA5_H。

点击Interface Template右边的栅格，下拉列表中选取Overall Framework   Hits:2XWT_BA_FV。

将Number of Models设为3。其它参数选择默认。

点击Run运行作业，等待作业完成（图3）。

待作业完成后，点击View Results查看结果，一个是名为MA5_L_MA5_H的序列窗口，另一个是名为MA5_L_MA5_H的分子窗口，包含了表面模板和三个模型结构（图4）。

2  模型的PDF值或者DOPE值分析

建模过程中，DS MODELER首先会提取模板（template）的几何特性，然后使用PDF（probability density function）函数来定义蛋白结构中诸如键长、键角、二面角等几何特性。接着它会对PDF函数施加一定的约束条件，并以此来构建target的3D结构。所以PDF的函数值可以直接反应所构建模型的好坏。一般，模型的PDF Total Energy越低，表明该模型在同源约束条件下优化的越好；模型同限定的同源约束条件偏差越小，该模型的可信度越大。然而，如果构建的模型其PDF Total Energy相似，则可以利用基于原子统计势能的DOPE score作为衡量模型质量的依据。DOPE是一个基于原子统计势能的程序，主要用于模型评估。它的分数可以认为是衡量同一分子不同构象可信度的标准，能够帮助选择预测结构的最优模型。分数越低，模型质量越可靠。三个模型的结构按照PDF Total Energy，PDF Physical Energy和DOPE Score升序排列。

在MA5_L_MA5_H分子窗口的表格视图（Table View）中，点击Molecule标签栏。

可以查看每个模型的PDF Total Energy，PDF Physical Energy，DOPE Score。比较每个模型之间的结构区别和与模板之间的结构区别。

在系统视图（Hierarchy View）中，展开MA5_L_MA5_H.M0002 | Modeler Groups。

在该组下可以看到，模型序列中同模板序列一致的（Identical）或者相似的（Similarity）以及没有比对上的（No Match）的氨基酸残基分别归于不同的组。

关闭Model Antibody Framework Report页面，Overall Framework Hits 分子窗口和序列窗口。

构建抗体LOOPS区结构

抗体结合抗原的选择性是由抗体可变区的CDR LOOP决定的。每个可变区都有3个超可变LOOP，L1，L2，L3，H1，H2，H3，它们形成了抗原结合位点，在本教程中我们将使用Model Antibody Loops protocol来识别模板，并使用这些模板来构建抗体中的CDR区域。DS可以基于序列识别出抗体中的高可变区，即互补决定区（CDR），并采用BLAST相似性搜索从抗体结构域以及CDR库中为每个CDR区搜索可能的loop模板，所搜寻到的模板将同相应的CDR区进行叠合。

点击激活MA5_L_MA5_H分子窗口。

在工具浏览器（Tools Explorer）中，展开Macromolecules | Model   Antibody，点击Model Antibody Loops，打开Model Antibody Loops对话框。

确保Input Protein Molecules为MA5_L_MA5_H: MA5_L_MA5_H.M0002。

设置Maximum Templates Per Loop为3。

将Build Models设为True，并展开该组，将Number of Models设为1。

其它选择默认。（图5）

点击Run运行任务。选择background使之在后台运行。

Model Antibody Loops protocol使用隐马尔科夫模型识别抗体中的可变区和相应CDR区，并运行一个相似性搜索，搜索预编译的抗体数据库，针对每个CDR LOOP寻找三个最匹配的模板，其中包括一个序列叠合的过程，叠合过程中将每个LOOP模板叠合到之前的抗体结构的CDR区，过程中使用MODELER基于命中的模板产生模型结构。待作业完成后，查看作业结果，双击任务栏的任务名称，打开任务报告。

该报告中包含了每个CDR区域LOOP残基，识别的模板，和模板LOOP打分，由于抗体结构有多条链，每条链的LOOP都列出在表中，同时，表单中还包括识别并使用的模板的分辨率，相似性和一致性，还有物种的来源等。

在报告页面中点击View Results链接。

同时自动打开两个新的窗口，一个是名为MA5_L_MA5_H_M0002的序列窗口，包含了两个模型序列（loop优化前和优化后）同loop模板序列的比对结果（图6），另一个是名为MA5_L_MA5_H_M0002的分子窗口，包含了loop模板结构和两个模型结构的叠合结果（图6）。

这两个窗口可以并排显示，并一一对应。

在分子窗口的系统视图中展开MA5_L_MA5_H_M0001_M.M00012|CDR Loops文件夹。

可以看到模型中重链和轻链各三个CDR区。

点击选中CDR Loops。

可以看到在分子窗口和序列窗口都分别由loop结构和序列被选中。

注：同一个模板结构可以用于构建多个CDR Loop结构，但是显示的时候则仍分开显示。

在分子窗口的表格视图（Table View）中点击Molecule标签栏。

在报告页面滚动滑轮，可以查看到loop优化前后模型的PDF Total Energy，PDF Physical Energy，DOPE Score，以及每个模板结构的打分及同目标序列中相应CDR区序列的一致性及相似性等诸多信息。

鼠标右键点击序列窗口中的标尺，选择Residue ID，将序列的残基号显示在序列窗口中。

模型评估

等模型构建完成后，一般需要对其进行评估。DS为用户提供了多种模型评估方式。主要包括：Ramachandran plot 和Profile-3D。具体操作参照Model_Enzyme教程。最终我们发现第一个模型是最好的。

将构建的模型结构与X射线晶体结构进行叠合

接下来，我们将使用蛋白叠合工具比较构建的最终的抗体模型和使用X射线获得的该抗体的晶体结构（PDB ID：4M6M）。

在文件浏览器（Files Explorer）中，双击打开Samples | Tutorials | Protein   Modeling | Ab05.pdb。将之前构建好的第一个抗体模型复制并黏贴到Ab05的分子窗口中，选中模型，点击菜单栏中Display Style右边的三角符号，选择第一种分子显示方式。

点击分子窗口空白处，取消模型选择。

点击Macromolecules | Superimpose Proteins 工具栏中Sequence Alignment右边的Create… 

点击之后，程序打开了一个包含两个结构的序列窗口和序列叠合流程设置窗口如下图：

使用窗口里面的默认设置，点击Run

计算完成后显示如下窗口：序列的相似性和一致性都达到99.6%

点击OK关闭该对话框。点击Ab05分子窗口,点击Macromolecules | Superimpose Proteins工具面板中的 Superimpose, 之后点击Show Report结果如下图所示

在窗口中抗体模型和晶体结构叠合在一起，227个残基的RMSD值为0.9

关闭右边的报告页面窗口

从上图叠合之后的图中可以看到叠合之后结构中的VL_LAMBDA_CDR3 和 VH_CDR3区域结构区别较大。

回到Ab05序列窗口。从菜单栏中选择Edit | Select….

设置Residue Property: Secondary structure 为 Sheet

点击OK如下图所示

鼠标右键点击序列窗口选择Extend Aligned Selection

点击Ab05分子窗口使之处于活跃状态。

从菜单中选择Structure | RMSD | Biopolymer Structures….

设置Referencemolecule为Ab05

选择我们构建的模型Calculate RMSD for molecules

选择Selected residues选项

选择C-Alpha，取消选择Amino acids下面的Main-chain，点击OK如下图

一个RMSD报告打开了，这个报告显示了结构中形成折叠的残基较低的Cα 原子的 RMSD（0.621），同时表明了结构的准确性。

激活Ab05分子窗口，打开层次视图，点击模型分子中的CDR LOOPS基团，选择VH_CDR3基团,接下来使用同样的方法计算LOOP的基于Cα 原子的RMSD为0.522如下图。

抗体全长3D结构的预测

载入序列

在文件浏览器（Files Explorer）中，双击打开LC.bmsl，HC.bmsl两个个序列文件。

上述两个序列依次分别为全长抗体的轻链（L）序列和重链（H）序列。

构建目标序列的3D模型

在工具浏览器（Tools   Explorer）中，展开Macromolecules   | Model Antibody，点击Model Full Length Antibody，打开Model Full Length Antibody对话框。

点击Light Chain Sequence右边的栅格，下拉列表中选取LC:Light。

点击Heavy Chain Sequence右边的栅格，下拉列表中选取HC:Heavy。

点击Template Source右边的栅格，下拉列表中选取1igv。

点击Copy Ligands右边的栅格，下拉列表中选取True。

将Number of Models设为1。

点击Optimization Level右边的栅格，下拉列表中选取Medium。（图7）

点击Run运行作业，等待作业完成。

待作业完成后，点击View Results查看结果。

同时自动打开两个新的窗口，一个是名为Light_Heavy的序列窗口，包含了模型序列同模板序列的比对结果，另一个是名为Light_Heavy的分子窗口，包含了模板结构和一个模型结构。这两个窗口可以并排显示，并一一对应。（图8）

注：同样根据体系仔细检查序列比对结果，如有必要，可以手动进行细微调整，然后基于新的比对结果采用Build Homology Models流程重新进行模型的构建。

在Light_Heavy分子窗口的系统视图（Hierarchy View）中，展开Protein Groups文件夹，点击Disulfide Residues可以显示抗体模型中形成二硫键的氨基酸残基。（图9）

后续操作同抗体Framework区模型构建步骤类似，不再详述。